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使用先进的荧光显微镜技术提高分辨率

来源:本站       阅读量:58     时间:2022-06-24 14:59:07

许多先进的荧光显微镜技术属于超分辨率显微镜 (SRM) 的范畴,与传统方法相比,它们可以实现更高的横向 (x, y) 分辨率。在 SRM 类别中,方法大致分为降低点扩散函数维数的方法(由于光衍射从每个荧光团发出的模糊大小)和基于通过空间或时间切换荧光团顺序可视化荧光团的方法。明暗状态。大多数 SRM 技术需要使用可光切换的荧光团。

受激发射耗尽显微镜 (STED) 是一种 SRM 技术,它通过关闭定义区域边缘的任何荧光团来降低点扩散函数。它通过将激发激光与第二个(更长波长)激光重叠以形成甜甜圈的形状来实现这一点,从而将外围荧光团的发射刺激到饱和/失活点。通过确保仅从甜甜圈中间的那些荧光团检测到荧光,STED 提供了仅 20 nm 的分辨率。

光激活定位显微镜 (PALM) 和随机光学重建显微镜 (STORM) 涉及以循环方式激活不同的荧光团子集。简而言之,弱的短波长激光激活一些荧光团,而较长波长的激光激发它们,从而收集发射。两种技术之间的主要区别在于,PALM 通常依赖于融合到感兴趣的目标(例如 PA-GFP、PA-mCherry1、PA-TagRFP)的常用荧光蛋白的可光激活 (PA) 版本的表达,而 STORM 使用可光活化的有机染料。此外,虽然 PALM 荧光团在激活、激发和定位后会被光漂白(允许对另一组荧光团进行成像),STORM 荧光团可以通过位于附近的活化剂染料重新活化,将来自数千个循环的定位结合起来用于图像构建。与传统荧光显微镜相比,PALM 和 STORM 技术分别将分辨率提高了 10 倍和 20 倍。


宽场荧光显微镜共聚焦显微镜STED棕榈STED
衍射极限?是的是的
成像模式宽场扫描扫描宽场宽场
方法全样本成像定义区域的成像使用两个不同的波长在定义区域边缘的荧光团受激发射耗尽空间上不同荧光团的随机激活,然后是激发、定位和光漂白空间上不同的可切换荧光团的随机激活,然后进行定位
空间/时间分辨率200 纳米512 像素 × 512 像素时为 200 nm / 5 ms20 nm,3.8 mW / 1 ms,10 µm 215 µm 20 nm / 1 分钟21500 µm 9 nm / 25 分钟2

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